Gruźlica wśród wielu chorób zakaźnych nadal pozostaje jedną z najczęstszych przyczyn zachorowań i zgonów na świecie (1). Szacuje się, że jedna trzecia ludności jest zakażona Mycobacterium tuberculosis, a większość tych zakażeń ma postać utajoną LTBI (Latent Tuberculosis Infection) (2). Szczególnie istotna w programach nadzoru nad gruźlicą jest identyfikacja osób z czynną gruźlicą, umożliwiająca wyleczenie chorego i zahamowanie rozprzestrzeniania się choroby. Śledzenie liczby osób z zakażeniem latentnym stanowi również ważny element tego nadzoru (1). Do chwili obecnej głównym narzędziem diagnostycznym w wykrywaniu zakażenia prątkiem gruźlicy była próba tuberkulinowa TST (Tuberculin Skin Test), której wyniki mogą być obarczone błędem (3). Niska specyficzność najstarszego z testów diagnostycznych wynika ze składu tuberkuliny, która jest mieszaniną antygenów wspólnych dla prątków chorobotwórczych, szczepu BCG i mykobakterii z grupy MOTT (Mycobacteria Other Than Tuberculosis). Do przyczyn niskiej czułości TST zalicza się upośledzenie odpowiedzi immunologicznej typu komórkowego i brak reakcji na tuberkulinę wynikającą z wieku pacjenta i złego stanu jego zdrowia (3, 4). W diagnostyce zakażenia M. tuberculosis coraz powszechniej stosuje się testy interferonowe oparte na antygenach ESAT-6 (Early Secretory Antigen Target 6) i CFP 10 (Culture Filtrated Potein 10 kDa) (2, 5, 6). Oba białka kodowane są w regionie RD1 genomu M. tuberculosis, region ten jest nieobecny u M. bovis BCG i prątków środowiskowych, dzięki czemu możliwe jest zmniejszenie liczby wyników fałszywie dodatnich w populacjach szczepionych BCG lub zakażonych większością prątków niegruźliczych za wyjątkiem M. kansasi, M. szulgai, M. marinum (7, 8, 9). W Polsce obecnie są dostępne dwa testy IGRA wykrywające zakażenie M. tuberculosis z krwi obwodowej badanego: QuantiFERON-Tb Gold (Cellestis, Australia) i T-SPOT.TB (Oxford Immunotec, Wielka Brytania). Zasada działania testów opiera się na ocenie ilości IFN-γ wytwarzanego przez limfocyty T na skutek ich stymulacji antygenami ESAT-6 i CFP 10 metodą ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay) – test QuantiFERON-Tb Gold lub metodą ELISpot (enzym linked immuno-spot assay) – test T-SPOT.TB (8, 10, 11).

Celem pracy, było porównanie wyników badań w kierunku rozpoznania latentnego zakażenia prątkiem gruźlicy przy użyciu dwóch komercyjnych testów IGRA (interferon-γ release assay): T-SPOT.TB, QuantiFERON-Tb Gold i próby tuberkulinowej TST.

Badaniem objęto 78 osób, które podzielono na dwie grupy: I. 25 zdrowych pracowników ochrony zdrowia – HCWs (Health Care Workers) i II. 53 chorych hospitalizowanych w Instytucie Gruźlicy i Chorób Płuc, u których wykluczono aktywną postać gruźlicy na podstawie ujemnych wyników badań mikrobiologicznych.

W analizowanej grupie były 42 kobiety i 36 mężczyzn w wieku od 12 do 70 lat (1 dziecko i 77 dorosłych). Wszyscy szczepieni BCG (tab. 1). Osobom biorącym udział w badaniu wykonano równocześnie testy T-SPOT.TB, QuantiFERON-Tb Gold i próbę tuberkulinową TST. W celu wykonania testów IGRA wszystkim badanym pobrano krew obwodową do odpowiednich probówek zgodnie z zaleceniami producentów testów IGRA i założono próbę tuberkulinową. Za wynik pozytywny testu T-SPOT.TB uznawano co najmniej 6 plam „spots”, czyli 6 limfocytów T wydzielających IFN-γ. Za wynik pozytywny testu QuantiFERON-Tb Gold uznawano poziom IFN-γ ≥ 0,35 IU/Ml. Próbę tuberkulinową wykonano stosując odmianę tuberkuliny PPD (purfied protein derivative) – tuberkulinę RT 23 (renset tuberculin, 23. seria). Wprowadzono ją śródskórnie w dłoniową powierzchnię przedramienia w ilości dwóch jednostek. Wynik odczytano po upływie 48-72 godzin, mierząc średnicę utworzonego nacieku poprzecznie do długiej osi przedramienia. Za wynik dodatni uznawano naciek większy bądź równy 10 mm, zgodnie z europejskimi rekomendacjami. Dla wszystkich 78 osób test TST wykonano w IGiChP. Za wykonanie próby tuberkulinowej i odczyt była odpowiedzialna ta sama osoba. Wśród 53 pacjentów hospitalizowanych w IGiChP, 46 miało podejrzenie gruźlicy i wykonane badania mikrobiologiczne (bakterioskopia, posiew, badanie genetyczne), u pozostałych 7 chorych prowadzono diagnostykę różnicową zmian płucnych. Na badania uzyskano zgodę Komisji Etycznej przy Instytucie Gruźlicy i Chorób Płuc nr KE-63/2005.

Wyniki TST przedstawiono w dwóch grupach, w zależności od wielkości średnicy nacieku. Wyniki ujemne < 10 mm stwierdzono u 56. Było to 15 (60%) pracowników ochrony zdrowia (HCWs) i 41 (77,3%) chorych hospitalizowanych w IGiChP. Wyniki pozytywne przy nacieku ≥ 10 mm stwierdzono u 22 osób. W grupie HCWs było to 10 (40%) osób, a w grupie chorych leczonych w IGiChP 12 (22,6%) (tab. 2).

W grupie 25 pracowników HCWs stwierdzono 5 (24%) pozytywnych wyników testu T-SPOT.TB, 6 (20%) QuantiFERON-TbGold i 10 (40%) próby tuberkulinowej. W grupie 53 chorych IGiChP było 6 (11,3%) pozytywnych wyników zarówno testu T-SPOT.TB i QuantiFERON-Tb Gold oraz 12 (22,6%) TST. Najwięcej pozytywnych wyników dla trzech porównywanych testów, przy uznaniu za punkt odcięcia nacieku o średnicy 10 mm, dawał test TST. W grupie 25 HCWs zaobserwowano więcej pozytywnych wyników testów IGRA i TST (ryc. 1).

Wśród 25 pracowników ochrony zdrowia (HCWs) u 2 osób wyniki testów IGRA były niezgodne. Niezgodności typu T.SPOT.TB-/QFT-G+ stwierdzono przy ujemnym wyniku TST, a niezgodność typu T.SPOT.TB+/QFT-G- zaobserwowano przy dodatnim wyniku TST. Wśród 4 (16%) osób z T.SPOT.TB+/QFT-G+, 1 (4%) osoba miała negatywny wynik TST, a pozostałe 3 (12%) miały pozytywny wynik TST. W badanej grupie 6 (24%) osób miało pozytywny wynik TST przy T.SPOT.TB-/QFT-G-. Ujemne wyniki wszystkich trzech testów stwierdzono dla 13 (52%) osób z grupy HCWs (tab. 3).

Z grupy 53 chorych leczonych w IGiChP wyłączono z analizy 1 osobę z nieokreślonym wynikiem testu QFT-G. W grupie 52 osób, 3 (5,7%) chorych miało pozytywne wyniki wszystkich 3 testów i 38 (73,1%) negatywne. W analizowanej grupie 6 (24%) wyników testów IGRA było rozbieżnych: 3 TSPOT.TB-/QFT-G+ i 3 T.SPOT.TB+/QFT-G-. Tylko dwóch z trzech chorych, którzy uzyskali niezgodne wyniki typu T.SPOT.TB-/QFT-G+ miało negatywne wyniki TST. W badanej grupie 5 (9,5%) chorych miało pozytywne wyniki TST przy T.SPOT.TB–/QFT-G- (tab. 3).

W tabelach 4 i 5 przedstawiono zgodność wyników testów IGRA i TST. Stwierdzono, że wyniki testów T-SPOT.TB i QFT-G są zgodne w 92% w grupie HCWs i w 88,5% w grupie chorych leczonych w IGiChP. Wyniki TST są w wyższych odsetkach zgodne z wynikami T-SPOT.TB zarówno w grupie HCWs (72%), jak i w grupie chorych IGiChP (90%). W grupie HCWs zgodność testów QFT-G i TST wynosiła 64%, a w grupie chorych IGiChP 80,8% (tab. 4 i 5).

W pracy przedstawiono wyniki pierwszego w Polsce porównania trzech testów wykrywających zakażenie prątkiem gruźlicy, dwóch testów IGRA: T-SPOT.TB i QuantiFERON-Tb Gold oraz stosowanej od wielu lat próby tuberkulinowej (TST). Testy wykonane dla 78 osób są wstępem do rozpoczętych przez nas badań dotyczących diagnostyki latentnego zakażenia prątkiem gruźlicy.

Z danych literaturowych wynika, że w populacjach szczepionych BCG, testy IGRA charakteryzują się wyższą specyficznością (90-99%) niż TST (60%) (3, 12, 13, 14, 15, 16). Wysoka czułość testów (70-97%) wynika z zasady ich działania, która polega na wykrywaniu IFN-γ wydzielanego przez limfocyty T stymulowane specyficznymi antygenami prątka gruźlicy (1, 2, 11, 12, 13, 14, 16, 17). Podobieństwo testów IGRA wynika z wykorzystania tych samych antygenów: ESAT-6 i CFP 10 oraz czasu trwania inkubacji krwi z tymi antygenami (16-20 h) (2, 12, 18). Główne różnice wynikają jednak z techniki pomiaru IFN-γ. W teście T-SPOT.TB wykorzystuje się technikę ELISpot polegającą na zliczaniu komórek limfocytów T wydzielających interferon, które dają obraz ciemnoniebieskich, okrągłych plam (spots) na membranie. Każda plama reprezentuje ślad pojedynczej komórki limfocytu T, która odpowiedziała na swoisty antygen produkując cytokinę (10). QFT-G wykorzystuje technikę ELISA do pomiaru stężenia IFN-γ (2, 10, 13). Poza tym testy IGRA są droższe od TST i wymagają odpowiedniego sprzętu laboratoryjnego (13, 19). Zaletą testów jest krótki czas uzyskania wyniku (1-2 dni), możliwość powtarzania testów bez efektu wzmocnienia (booster), który występuje w przypadku próby tuberkulinowej i jednorazowa wizyta pacjenta w placówce ochrony zdrowia (13, 18). Porównanie wyników uzyskanych testami IGRA i TST jest ograniczone przez brak złotego standardu w diagnozowaniu ukrytego zakażenia prątkiem gruźlicy (20).

W badaniach własnych wyniki pozytywne testu TST stwierdzono u 22 z 78 osób, co stanowi 28% wszystkich badanych. Zaobserwowano prawie dwukrotnie większy odsetek (40%) pozytywnych wyników TST w grupie 25 pracowników ochrony zdrowia (HCWs) w porównaniu z grupą 53 chorych hospitalizowanych w IGiChP (22,6%). W badaniach własnych za punkt odcięcia TST przyjęto 10 mm, podobnie jak w wielu pracach (1, 20, 21, 22, 23). Tissot i wsp. stwierdzili, że odsetek pozytywnych wyników TST wśród szwajcarskiej grupy HCWs wynosił 27% i był niewiele niższy, gdy za punkt odcięcia przyjęto 5 mm (21), a wśród norweskich HCWs wynosił 11% (22). Barsegian i wsp. stwierdzili, że wśród niemieckiej grupy HCWs odsetek pozytywnych wyników TST wynosił 34%. Odsetek pozytywnych wyników TST autorzy ww. analizy tłumaczą immunizacją personelu różnymi szczepami prątków niegruźliczych i wpływem wcześniejszego szczepienia BCG, które w tych krajach, tak jak w Polsce jest powszechne (15).

W badaniach własnych stwierdzono niezgodności pomiędzy wynikami testów T-SPOT.TB, QFT-G i TST, które przedstawiono w tabeli 3. Lee i wsp. analizując wyniki testów IGRA i TST, stwierdzili że niezgodność typu QFT-G+/T.SPOT.TB+/TST- może być związana z obniżoną odpornością pacjentów i brakiem reakcji na tuberkulinę. Lalvani i wsp. sugerują, że problemem jest punkt odcięcia IGRA, od którego zależy czułość badania. Istotne jest to, że testy IGRA wykrywają świeże zakażenie prątkiem, za które odpowiedzialne są limfocyty T efektorowe, a w przypadku TST limfocyty T pamięci, które nie zostały jeszcze pobudzone do produkcji IFN-γ (6, 11, 13). Na niezgodność typu QFT-G-/T.SPOT.TB-/TST+ może mieć wpływ wcześniejsze szczepienie BCG i immunizacja niegruźliczymi prątkami (2).

Cehovin i wsp. zasugerowali, że zbyt krótki czas inkubacji krwi z antygenami prątka w czasie wykonywania testów IGRA może mieć wpływ na ujemne wyniki testów. W swoich badaniach wydłużyli czas inkubacji krwi z antygenami w teście QFT-G i początkowo ujemny wynik stawał się dodatni. Zaobserwowali również niezgodności między testami IGRA. Niezgodność typu QFT-G+/T.SPOT.TB-/TST- sugeruje, że test QFT-G może dawać fałszywie pozytywne wyniki, natomiast rozbieżności typu QFT-G-/T.SPOT.TB+/TST- lub TST+ jest niezrozumiała (24). Możliwym wyjaśnieniem jest to, że test T-SPOT.TB daje wyniki fałszywie dodatnie lub że badani pacjenci byli długotrwale zakażeni M. tuberculosis lub innymi prątkami zawierającymi w swoim genomie region RD1 (2). W badaniach własnych stwierdzono większość z opisanych niezgodności oprócz T-SPOT.TB+/QFT-G-/TST-. Z przeglądu literatury wynika, że poziom niezgodności zależy od przyjętego punktu odcięcia zarówno testów IGRA, jak i TST. Przedstawione problemy związane ze zgodnością testów mogą być rozwiązane wyłącznie przez dalsze obserwacje dużych i różnorodnych populacji ludzi poddanych badaniom w kierunku wykrycia latentnego zakażenia prątkiem gruźlicy.

W naszej pracy analizowano również zgodność wyników pomiędzy poszczególnymi parami testów. Większy odsetek zgodnych wyników testów TST i T-SPOT.TB zaobserwowano zarówno w grupie HCWs (72%), jak i w grupie chorych IGiChP (90%). Zgodność QFT-G i TST wynosiła odpowiednio w zależności od analizowanej grupy 64 i 80,8%. Dominguez i wsp. badali zgodność testów IGRA i TST w różnych grupach chorych i stwierdzili, że wśród szczepionych BCG i podejrzanych o LTBI zgodność pomiędzy T-SPOT.TB i TST wynosiła 74,3%, pomiędzy QFT i TST 66,3%, a pomiędzy testami IGRA 86% (14). Ten procentowy rozkład jest podobny jak w prezentowanych przez nas badaniach. Stefan i wsp. porównywali zgodność 3 testów w grupie dzieci z chorobami nowotworowymi. Stwierdzili najwyższą zgodność wyników pomiędzy testami IGRA, kolejno QFT i TST, a najniższą pomiędzy T-SPOT.TB i TST. Największy odsetek pozytywnych wyników potwierdzających LTBI wśród dzieci uzyskano za pomocą testu T-SPOT.TB (20). Potwierdza to wcześniejsze obserwacje, które wykazały większą czułość T-SPOT.TB w niektórych subpopulacjach np. dzieci i pacjentów w immunosupresji (17). Bienek i wsp. stwierdzili ogólną zgodność testów T-SPOT.TB i TST na poziomie 98,2% analizując grupy o niskim i nieokreślonym ryzyku LTBI (3). Leung i wsp. stwierdzili zgodność pomiędzy T-SPOT.TB i TST przy średnicy odczynu ≥ 10 mm 76,9% (25). Ewer i wsp. diagnozując LTBI w grupie uczniów w wieku od 10-15 lat stwierdzili 89% zgodność wyników. Stwierdzili, że pozytywne wyniki TST były znacznie częstsze wśród szczepionych niż nie szczepionych uczniów, podczas gdy szczepienie nie miało wpływu na wyniki T-SPOT.TB (4). Nienhaus i wsp. porównali rezultaty uzyskane testem QFT i TST wśród urodzonych w Niemczech, młodszych niż 40 lat i nie szczepionych BCG osób. Ogólną zgodność testów stwierdzili na poziomie 95,6% przy punkcie odcięcia TST równym 10 mm (26). Weinfurter i wsp. porównywali zgodność wyników QFT i TST wśród grup wysokiego ryzyka zakażenia M. tuberculosis (bezdomni, zarażeni wirusem HIV) i stwierdzili 86,7% zgodność wyników (27). Mazurek i wsp. analizowali zgodność testów IGRA z TST wśród osób z różnym stopniem ryzyka zakażenia prątkiem gruźlicy oraz u osób z podejrzeniem aktywnej gruźlicy. Ogólna zgodność pomiędzy TST i IGRA wynosiła 83,1% (19). W badaniach własnych zgodności pomiędzy testami IGRA (T-SPOT.TB i QFT-G) była wyższa w grupie pracowników ochrony zdrowia (92%) niż wśród chorych hospitalizowanych w IGiChP (88,5%), którzy mieli wykluczoną aktywną postać gruźlicy na podstawie ujemnych wyników badań mikrobiologicznych.

1. Stwierdzono wysoką zgodność wyniki testów IGRA w obu grupach badawczych 92 i 88,5%.

2. Stwierdzono wyższą zgodność pomiędzy wynikami testów TST i T-SPOT.TB zarówno w grupie HCWs 72%, jak i w grupie chorych hospitalizowanych w IGiChP 90%. Zgodność pomiędzy wynikami TST i QuantFERON-Tb Gold wynosiła odpowiednio 64 i 80,8%.

3. Z przeprowadzonej analizy wynika, że rozpoznanie latentnego zakażenia prątkiem gruźlicy nie może opierać się jedynie na pojedynczym wyniku testu IGRA lub TST. Wyniki testów stwierdzających LTBI mogą być niezgodne. Na obecnym poziomie wiedzy nie wszystkie przyczyny niezgodności wyników pomiędzy testami są wytłumaczalne. W przypadku wyników niezgodnych należy powtórzyć badanie.