Właściwe zaopatrzenie organizmu w witaminę D odgrywa fundamentalną rolę nie tylko w regulacji gospodarki Ca-P, ale także zapewnia prawidłowe funkcjonowanie niemal wszystkich tkanek i narządów. Wykazano, że niedobory i deficyty witaminy D są czynnikiem ryzyka wystąpienia i rozwoju chorób nowotworowych, autoimmunologicznych, sercowo-naczyniowych oraz cukrzycy (1, 2). Udokumentowano, że pozanerkowa synteza aktywnego metabolitu witaminy D, czyli 1,25(OH)₂D ma kluczowe znaczenie dla funkcji układu immunologicznego i wewnątrzwydzielniczego, a także dla równowagi między proliferacją, różnicowaniem się i apoptozą komórkową (3-8). 25(OH)D, ze względu na długi okres półtrwania (około 3 tygodni) jest głównym parametrem oceny zaopatrzenia organizmu w witaminę D (9). Pomiar stężenia 25(OH)D w surowicy informuje o ilości substratu dostępnego dla syntezy aktywnego hormonalnie 1,25(OH)₂D. Oznaczanie 25(OH)D w surowicy jest procedurą trudną z trzech podstawowych przyczyn: 1) dużej hydrofobowości 25(OH)D, co wiąże się z zagrożeniem interferencji licznych składników surowicy (tak zwany „efekt matrix”); 2) występowaniem w surowicy zarówno pochodnych witaminy D₂, jak i D₃; 3) występowaniem w surowicy stereoizomeru 3-epi-25(OH)D₃ (10, 11). Notowane ostatnio znaczące zwiększenie zapotrzebowania na ocenę zaopatrzenia w witaminę D pacjentów z bardzo wielu grup ryzyka spowodowało konieczność opracowania nowych i łatwo dostępnych metod oznaczania 25(OH)D w surowicy. Zgodnie z aktualnymi zaleceniami (1, 2), automatyczne platformy LIAISON i ELECSYS wprowadziły procedury równoczesnego oznaczania 25(OH)D₂ i 25(OH)D₃ [25(OH)D Total] w surowicy, które wykorzystujemy do badań w materiale pediatrycznym IPCZD. Badania te podlegają międzynarodowej kontroli jakości oznaczeń metabolitów witaminy D w systemie certyfikującym DEQAS (The International External Quality Assessment Scheme for Vitamin D Metabolites) (12-14).

Celem pracy była analiza precyzji i dokładności oznaczeń 25(OH)D Total w surowicy metodami automatycznymi na analizatorach ELECSYS i LIAISON z wykorzystaniem materiału pediatrycznego IPCZD oraz próbek kontrolnych systemu DEQAS.

Do badań precyzji oznaczeń 25(OH)D Total na analizatorach LIAISON i ELECSYS wykorzystano mieszaninę surowic (surowica zlewkowa) pozostałych po rutynowych oznaczeniach 25(OH)D u pacjentów Instytutu „Pomnik – Centrum Zdrowia Dziecka” (IPCZD). Do badań powtarzalności surowicę zlewkową dzielono na porcje odpowiadające jednemu badaniu. Badania powtarzalności wykonywano w trakcie jednego dnia prowadzenia oznaczeń. Do badań odtwarzalności próbkę surowicy zlewkowej także dzielono na porcje odpowiadające jednemu badaniu, przy czym oznaczenia prowadzono w odrębnych cyklach uruchamiania aparatów. 114 próbek surowicy pochodzącej od pacjentów IPCZD wykorzystano do oceny zgodności wyników oznaczeń 25(OH)D Total wykonanych na analizatorze LIAISON względem ELECSYS. Analizy przeprowadzone na posiadanym materiale zostały wykonane w ramach badań statutowych poszerzonej kontroli jakości w Zakładzie Biochemii i Medycyny Doświadczalnej (ZBiMD) IPCZD. Badania nie wymagały zgody komisji etycznej. Badacze nie mieli dostępu do danych osobowych pacjentów.

Do analizy dokładności oznaczeń wykonywanych w ZBiMD wykorzystano wyniki badań próbek kontrolnych otrzymanych w ramach międzynarodowego systemu kontroli jakości DEQAS. Kontrola DEQAS prowadzona jest w ZBiMD od 2009 roku na analizatorze LIAISON (certyfikat DEQAS) i od 2011 roku na analizatorze ELECSYS (uzyskanie certyfikatu planowane na rok 2012). Wyniki badań metodą HPLC i LC-MS/MS pochodzą z informacji dostarczanych uczestnikom systemu kontroli jakości DEQAS. Do analizy zgodności metod oznaczania 25(OH)D Total na LIAISON i ELECSYS z HPLC i LC-MS użyto próbek kontrolnych nr 351-405 otrzymanych w ramach systemu DEQAS. Wartości stężeń 25(OH)D oznaczone metodą HPLC i LC-MS stanowią wartość średnią z badań wykonanych przez uczestników systemu DEQAS. Wyniki badań metodą HPLC stanowią średnią wyników z 23-26 ośrodków (w zależności od numeru próbki) uczestniczących w systemie DEQAS. Wyniki badań metodą LC-MS stanowią wartość średnią wyników z 52-104 ośrodków (w zależności od numeru próbki) uczestniczących w systemie DEQAS. Na wykorzystanie w pracy wyników z systemu DEQAS wyraził zgodę dr Graham D. Carter.

„Vitamin D Total” (ELECSYS Roche Diagnostics) jest kompetycyjnym testem wykorzystującym zjawisko elektrochemiluminescencji, gdzie do identyfikacji 25(OH)D₂ i 25(OH)D₃ zastosowano białko wiążące witaminę D (ang. vitamin D binding protein – DBP) znakowane rutenem. We wstępnej fazie oznaczenia, przy użyciu odczynnika zawierającego ditiotreitol (1 g/l) oraz NaOH (55 g/l) następuje uwolnienie zawartej w próbce 25(OH)D z DBP. Kolejnym etapem jest inkubacja badanej próbki z DBP znakowanym rutenem, w czasie której 25(OH)D obecne w próbie wiąże się z kompleksem DBP-ruten. Następnie do mieszaniny dodawane są paramagnetyczne cząstki opłaszczone streptawidyną oraz 25(OH)D znakowana biotyną, która wiąże się z kompleksem DBP-ruten w pozostałych wolnych miejscach. Dzięki oddziaływaniom 25(OH)D z DBP oraz biotyny ze streptawidyną powstaje wielowarstowy kompleks kanapkowy (ang. sandwich complex). Po inkubacji mieszanina reakcyjna zostaje przeniesiona do komory pomiarowej, gdzie jest wychwytywana przez elektrodę na zasadzie magnetycznych oddziaływań pomiędzy elektrodą a cząstkami paramagnetycznymi. Następuje elektryczna inicjacja reakcji z udziałem rutenu, której produkt stanowią fotony światła zliczane przez fotopowielacz. Ich liczba jest odwrotnie proporcjonalna do ilości oznaczanej 25(OH)D, a jej stężenie zostaje odczytane z krzywej kalibracyjnej.

„Liaison 25OH Vit D Total” (LIAISON, Biomedica Gruppe) jest kompetycyjnym testem wykorzystującym zjawisko elektrochemiluminescencji, gdzie do identyfikacji 25(OH)D₂ i 25(OH)D₃ zastosowano specyficzne przeciwciało. W trakcie pierwszej inkubacji odczynnik zawierający 10% etanolu oraz detergent powoduje uwolnienie 25(OH)D zawartej w próbce badanej z DBP. Wolna 25(OH)D ulega wiązaniu z przeciwciałem opłaszczającym cząstki paramagnetyczne. W następnym etapie dodawana jest znakowana izoluminolem witamina D, która współzawodniczy z 25(OH)D zawartą w próbce badanej o wiązanie z przeciwciałem. Po inkubacji materiał niezwiązany usuwany jest w trakcie płukania. W końcowej fazie oznaczenia dodawany jest odczynnik inicjujący reakcję, której produktem są fotony świetlne zliczane za pomocą fotopowielacza. Ich ilość jest odwrotnie proporcjonalna do stężenia 25(OH)D w próbce badanej, odczytywanego z krzywej kalibracyjnej.

Analizę statystyczną przeprowadzono przy pomocy programu Statistica 8.0 PL (Statsoft, USA) oraz 15-dniowej wersji testowej programu Medcal 9.3 (Mariekerke, Belgia). Korelacje oceniono testem Pearsona, a współczynnik determinacji obliczono metodą regresji liniowej opartej o dopasowanie krzywej regresji metodą najmniejszych kwadratów. Kierunki różnic między poszczególnymi metodami określono za pomocą analizy Blanda-Altmana. Za poziom istotności przyjęto wartość p < 0,05 (15-18).

Metody oznaczania 25(OH)D Total na analizatorach ELECSYS i LIAISON wykazują wysoką i porównywalną precyzję wewnątrzoznaczeniową (powtarzalność), jak i międzyoznaczeniową (odtwarzalność) w materiale pediatrycznym (tab. 1). Wykazano, że wartości błędów powtarzalności i odtwarzalności w materiale pediatrycznym nie różniły się od danych producenta wykonanych z użyciem surowic pobranych od pacjentów dorosłych (tab. 1).

Wyniki badania zgodności wyników 25(OH)D Total w 114 surowicach pediatrycznych poddanych oznaczeniom na analizatorach LIAISON i ELECSYS prezentuje rycina 1. Analiza regresji liniowej ujawniła wysoką zgodność wyników oznaczeń tych samych próbek wyżej podanymi metodami (R² = 0,8272). Według najnowszych zaleceń dotyczących oceny zaopatrzenia organizmu w witaminę D obie porównywane metody automatyczne oznaczają równocześnie 25(OH)D₂, i 25(OH)D₃. Jednak do identyfikacji tych metabolitów używają różnych technik: system LIAISON wykorzystuje oddziaływanie ze specyficznym przeciwciałem, a system ELECSYS – z DBP. Dlatego też, pomimo wysokiej zgodności w badaniu metodą regresji (ryc. 1), różnice w specyficzności dwóch metod ujawniła analiza Blanda-Altmana. Jak wynika z ryciny 1, wykazano 22,5-procentową różnicę w zgodności wyników stężenie 25(OH)D oznaczanego obiema metodami.

Aby ocenić dokładność oznaczeń 25(OH)D Total na analizatorze LIAISON przeprowadzono analizę zgodności wyników otrzymanych powyższą metodą z wynikami oznaczeń dwoma metodami bezpośrednimi, fizykalnymi, uznawanymi za „złote standardy” w oznaczeniach 25(OH)D₂ i 25(OH)D₃: wysokosprawną chromatografią cieczową (HPLC) i spektrometrią masową sprzężoną z chromatografią cieczową (LC-MS). Metoda wykorzystywana w systemie LIAISON wykazała wysoką zgodność wyników zarówno z metodą HPLC (R² = 0,8236, ryc. 2A), jak i z metodą LC-MS (R² = 0,8153) w analizie regresji (ryc. 2B). Jednak analiza Blanda-Altmana ujawniła, że oznaczenia wykonane na analizatorze LIAISON są o 11,6% niższe względem metody HPLC i o 10,8% niższe względem LC-MS.

Podobnie ocena systemu ELECSYS wykazała, że metoda ta jest w stopniu wysokim zgodna zarówno z metodą HPLC (R² = 0,9136, ryc. 3A), jak i z metodą LC-MS (R² = 0,8400) w analizach regresji liniowej (ryc. 3B). W analizie Blanda-Altmana wyniki oznaczeń na analizatorze ELECSYS okazały się wysoce zgodne zarówno z metodą HPLC (różnica: -0.1%, ryc. 3A), jak i z metodą LC-MS (różnica: -3,1%, ryc. 3B). Warto zaznaczyć, że w analizie dotyczącej systemu LIAISON ilość próbek wynosiła 54, natomiast systemu ELECSYS – tylko 14.

Przeprowadzone badania wykazały, że szeroko dostępne w Polsce dwie metody do oznaczania całkowitej 25(OH)D [25(OH)D₃ i 25(OH)D₂] w surowicy, a więc systemy analityczne LIAISON i ELECSYS, charakteryzują się wysoką precyzją oznaczeń w materiale pediatrycznym (błąd < 8%) oraz udokumentowaną dokładnością względem referencyjnych metod bezpośrednich HPLC i LC-MS uznawanych za „złoty standard”.

Chociaż obie metody równocześnie oznaczają 25(OH)D₂ oraz 25(OH)D₃ spełniając standardy określone w ostatnich zaleceniach (1, 2), to ich specyficzność w stosunku do metabolitów witaminy D obecnych w surowicy jest różna, co manifestuje wykazana 22-procentowa różnica między wynikami oznaczeń w systemie LAISON i ELECSYS. Metoda oznaczeń na analizatorze LIAISON wykorzystuje przeciwciało, a jego specyficzność względem 25(OH)D₃, 25(OH)D₂, 1,25(OH)₂D₃, 1,25(OH)₂D₂, witaminy D₃, witaminy D₂ i C3-epimeru-25(OH)D₃ wynosi odpowiednio 100%, 104%, 17%, 40%, <1%, <1% i <1% (dane producenta). Metoda oznaczeń w systemie ELECSYS wykorzystuje białko wiążące witaminę D (DBP), a jego specyficzność względem 25(OH)D₃, 25(OH)D₂, 24,25(OH)₂D₃, 1,25(OH)₂D₃, 1,25(OH)₂D₂, witaminy D₃, witaminy D₂ i C3-epimeru-25(OH)D₃ wynosi odpowiednio 98%, 81%, 121%, 5%, 6%, 5%, 6% i 93% (dane producenta). W efekcie opisanych powyżej różnic metodycznych ujawniona rozbieżność wyników oznaczeń 25(OH)D między systemem LIAISON i ELECSYS wynika najprawdopodobniej z 20% różnicy w specyficzności względem 25(OH)D₂ oraz 93% różnicy w specyficzności względem C3-epimeru-25(OH)D₃, który w surowicy ludzkiej występuje w ilości (2-20)% (10, 11, 19, 20).

Udokumentowana w pracy wysoka precyzja badanych metod automatycznych (błąd < 8%) przełamuje problem niskiej wiarygodności oznaczeń witaminy D metodami manualnymi, pośrednimi wykorzystującymi wiązanie 25(OH)D z białkami, takimi jak DBP (metoda CPBA, ang. competitive protein binding assay) czy przeciwciałem (metoda RIA, ang. radioimmunoassay, i metoda ELISA, ang. enzyme-linked immunoassay), gdzie błąd metody wynosił 20-30% (21). Rozpowszechnienie metod automatycznych spowodowało poprawę precyzji oznaczeń 25(OH)D odnotowaną w systemie DEQAS (13). Zmienność analityczna obu metod w badanym w pracy materiale pediatrycznym jest porównywalna do wyników otrzymanych w badaniach osób dorosłych (22-24).

Dokładność metod oznaczania 25(OH)D w surowicy oceniono względem referencyjnych metod bezpośrednich uznawanych za „złoty standard”: wysokosprawnej chromatografii cieczowej (HPLC) oraz spektrometrii masowej sprzężonej z chromatografią cieczową (LC-MS). Metody te mają możliwość oceny stężenia osobno 25(OH)D₃ i 25(OH)D₂, ale nie wszystkie umożliwiają rozróżnienie C3-epimeru-25(OH)D₃ od 25(OH)D₃ (25-26). Przyjmuje się, że ich specyficzność względem 25(OH)D₃, 25(OH)D₂ oraz C3-epimeru-25(OH)D₃ wynosi 100%. Ocena dokładności oznaczeń 25(OH)D Total na analizatorze LIAISON wykazała wysoką korelację zarówno z metodą HPLC, jak i z metodą LC-MS. Mimo to system LIAISON generował wyniki niższe o około 10% w porównaniu z HPLC i LC-MS. Obserwacja ujawniona w naszym badaniu jest zgodna z danymi opublikowanymi w literaturze (14, 19, 23). Porównanie wyników oznaczeń 25(OH) Total na analizatorze ELECSYS z metodami HPLC i LC-MS wykonane zostało na niewielkiej ilości próbek, ponieważ test ten wprowadzono w maju 2011 roku i kontrola DEQAS objęła jedynie 14 próbek testowych. W przypadku systemu ELECSYS, mimo znacząco mniejszej liczby oznaczeń (n = 14), zaobserwowano wysoką zgodność względem metod referencyjnych (różnica wyniosła -0,1% oraz -3,1%, odpowiednio dla HPLC i LC-MS).